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禽腺病毒I群(FADV-I）核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法) |
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禽腺病毒I群(FADV-I）核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法)
【產品名稱】 商品名稱：禽腺病毒I群 (FADV-I）核酸檢測試劑盒(熒光-PCR法）
【包裝規(guī)格】50T/盒
【預期用途】 禽腺病毒感染主要感染家禽，一旦感染容易通過家禽消化道及呼吸道進行擴散，引起家禽暴發(fā)流行性疾病，引起病雞出現(xiàn)精神不振、排稀糞便，心包積液滲出、肝脹腫脹出血，造成家禽死亡，禽腺病毒I群為常見型，包括A\B\C\D\E型。本試劑盒適用于檢測呼吸道分泌物棉拭子（感染I群禽腺病毒的雞、火雞、鵝、鵪鶉）、卵巢、輸卵管、卵泡、子宮和輸卵管粘膜組織、泄殖腔拭子（感染I群禽腺病毒的雞、鴨）等樣本中的禽腺病毒感染的輔助診斷，其檢測結果僅供參考。
【檢驗原理】 本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術，選用3套引物探針組合，包含禽腺病毒I群的A型,C型,E型的特異性基因，分別設計1對特異性引物，并結合1條特異性探針，用熒光PCR技術對禽腺病毒的核酸進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用。
【儲存條件及有效期】 -20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融少于7次，有效期12個月。
【適用儀器】 ABI 、安捷倫MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf等系列熒光定量PCR檢測儀。
【標本采集】 病死禽取卵巢、輸卵管、卵泡、子宮和輸卵管粘膜組織；活雞取呼吸道拭子或泄殖腔拭子，放于1mL 50%甘油生理鹽水中。
【保存和運輸】 上述標本短期內可保存于-20℃，長期保存可置-70℃，但不能超過6個月，標本運送應采用2~8℃冰袋運輸，嚴禁反復凍融。
【使用方法】 1. 樣品處理（樣本處理區(qū)） 1.1 樣本前處理 組織樣品：每份組織分別從3個不同的位置稱取樣品約1g，手術剪剪碎混勻后取0.5g于研磨器中研磨，加入1.5mL生理鹽水后繼續(xù)研磨，待勻漿后轉至1.5mL滅菌離心管中，8000rpm離心2min，取上清液100μL于1.5mL滅菌離心管中；泄殖腔拭子直接取100μL進行DNA提取。
1.2 DNA提取 為了使實驗結果穩(wěn)定、有效、可靠，建議使用商品化的RNA 提取試劑盒進行提取，嚴格按照對應試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制（試劑準備區(qū)） 根據待檢測樣本總數(shù)，設所需要的PCR反應管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照；樣品每滿7份，多配制1份)，每測試反應體系配制如下表：
3. 加樣（樣本處理區(qū)） 將步驟1提取的DNA、陽性質控品、陰性質控品各取5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。
4. PCR擴增（核酸擴增區(qū)） 4.1 將待檢測反應管置于熒光定量PCR儀反應槽內； 4.2 設置好通道、樣品信息，反應體系設置為25μL； 熒光通道選擇： 檢測通道（Reporter Dye）FAM檢測禽腺病毒A型，淬滅通道（Quencher Dye）NONE，請勿選擇ROX參比熒光。 4.3 推薦循環(huán)參數(shù)設置：
5. 結果分析判定 5.1 結果分析條件設定 設置Baseline和Threshold：一般直接按機器自動分析的結果分析，當曲線出現(xiàn)整體傾斜時，根據分析后圖像調節(jié)Baseline的start值(一般可在3~15范圍內調節(jié))、stop值(一般可在5~20范圍內調節(jié))，以及Threshold的Value值(上下拖動閾值線至高于陰性對照)，重新分析結果。
5.2 結果判斷 陽性：檢測通道Ct值≤35.0，且曲線有明顯的指數(shù)增長曲線。 可疑：檢測通道35.0<Ct值<38.0，且出現(xiàn)典型擴增曲線的樣本建議重復試驗，重復試驗結果出現(xiàn)Ct值<38.0且有典型擴增曲線者為陽性，否則為陰性。 陰性：樣本檢測結果無Ct值且無明顯的擴增曲線。
6. 檢測方法的局限性 ? 樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關； ? 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現(xiàn)假陽性結果； ? 陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果； ? 病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果； ? 不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果； ? 試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現(xiàn)假陰性或定量檢測不準確的結果； ? 本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
7. 質控標準 陰性質控品：無明顯擴增曲線且無Ct值顯示； 陽性質控品：擴增曲線有明顯指數(shù)生長期，且Ct值≤30； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。
8. 性能指標 （1）敏感性：內控樣本敏感性為100%，綜合評價敏感性98%以上。最低檢測限不低于1000copies/ml。 （2）特異性：100%。 （3）穩(wěn)定性：批內及批間差異≤3%。
【注意事項】 ? 所有操作嚴格按照說明書進行； ? 試劑盒內各種組分使用前應自然融化，完全混勻并短暫離心； ? 反應液應避光保存； ? 反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊； ? 使用一次性吸頭、一次性手套和各區(qū)專用工作服； ? 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區(qū)進行，以免交叉污染； ? 實驗完畢后用10%次氯酸或75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器； ? 試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫(yī)學實驗室生物安全通則》進行處理。
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