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免疫組織化學(xué)工作流程

1 石蠟切片脫蠟和水化后，用PBS（PH7.4）沖洗三次，每次5分鐘。
PBS配制 （2000ml）PH7.4
氯化鈉： 17g
磷酸二氫鈉：0.4g
磷酸氫二鈉：6.3g
2 根據(jù)每一種抗體的要求，對(duì)組織抗原進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)。我科采用壓力鍋進(jìn)行抗原修復(fù)，取一定量的修復(fù)液于壓力鍋中，加熱至沸騰，將脫蠟水化后的組織切片置于不銹鋼或耐高溫塑料切片架上，放入已沸騰的緩沖液中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)加熱至噴氣，從噴氣開(kāi)始計(jì)時(shí)，2分鐘后，壓力鍋離開(kāi)熱源，冷卻至室溫（也可以稍冷后，在自來(lái)水下加速冷卻）。取出玻片，先用蒸餾水沖洗兩遍（用蠟在組織周?chē)鷦澣?，防止抗體跑散，但圈要大一點(diǎn)），之后用PBS（PH7.4）沖洗三遍。每次5分鐘。
檸檬酸緩沖液的配制（PH6.0）
0.1M檸檬酸：（4.2g+200ml蒸餾水）
0.1M檸檬酸三鈉 （14.7g+500ml蒸餾水）
取檸檬酸三鈉41ml+檸檬酸9ml加入450ml蒸餾水中，總量為500ml即可。
3  配制3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，孵育十分鐘。
PBS90 ml+30 %過(guò)氧化氫10 ml，現(xiàn)用現(xiàn)配并搖勻，蓋上蓋子，防止見(jiàn)氧分解揮發(fā)。
4  PBS沖洗三次，每次5分鐘。
5  滴加4 %羊血清封閉，室溫30分鐘，以減少非特異性染色。
PBS10 ml+正常羊血清400 ul
6  甩去羊血清，根據(jù)不同的項(xiàng)目配制并滴加不同的一抗，濃縮型的抗體一定要在購(gòu)買(mǎi)后先用已知的陽(yáng)性片做梯度實(shí)驗(yàn)，根據(jù)結(jié)果情況找出*稀釋濃度再用到臨床診斷。工作液也應(yīng)該在購(gòu)買(mǎi)后先用已知的陽(yáng)性片檢測(cè)抗體的染色效果，直接滴加即可。每次還應(yīng)帶上陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，以保證結(jié)果的可靠性。每張切片滴加足夠量的一抗并放入濕盒，防止切片干燥影響結(jié)果，室溫孵育2小時(shí)。
抗體稀釋液的配制 牛血清白蛋白：2mg
疊氮鈉： 10～20ml
雙蒸水： 10ml
7  PBS沖洗三次，每次5分鐘。
8  滴加二步法EnVision TM孵育30分鐘。
9  PBS沖洗三次，每次5分鐘。
10  甩去PBS液，每張切片滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下觀察，陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色或棕褐色。一般顯色時(shí)間為5分鐘左右，終止反應(yīng)，自來(lái)水充分沖洗。
11  蘇木素復(fù)染，0.1%鹽酸酒精分化，氨水返蘭或自來(lái)水返蘭（自來(lái)水返蘭時(shí)間要稍長(zhǎng)些，應(yīng)該在顯微鏡下看以下蘇木素復(fù)染情況），自來(lái)水沖洗。
12  梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，閱片并總結(jié)染色結(jié)果。