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過氧化物酶(POD)活性檢測試劑盒說明書
微量法
注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。
規(guī)格：100T/96S 產(chǎn)品內(nèi)容：
提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存； 試劑一：液體 20mL×1 瓶，4℃保存；
試劑二：液體 0.2mL×1 瓶，4℃保存；用時加入 3mL 試劑一，現(xiàn)配現(xiàn)用，可 4℃保存一周； 試劑三：液體 3 mL×1 瓶，4℃保存。
產(chǎn)品說明：
POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在于動物、植物、微生物中，可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。POD 在有過氧化氫存在的情況下，能使愈創(chuàng)木酚發(fā)生氧化，生成茶褐色物質(zhì)，該物質(zhì)在 470nm 有最大光吸收。
需自備的儀器和用品：
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水
操作步驟：
一、粗酶液提取：
1、細菌、細胞或組織樣品的制備
收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照每 500 萬細菌或細胞加入 1mL 提取液，超聲波破碎細菌或細胞（功率 20％，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提取液進行冰浴勻漿；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。
2、血清（漿）樣品：直接檢測。二、測定步驟：
1、 分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 470nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 測定前將試劑一、二和三在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）放置 10min 以上。
3、 樣本測定表
試劑名稱（µL） | 測定管 |
試劑一 | 120 |
試劑二 | 30 |
試劑三 | 30 |
蒸餾水 | 60 |
樣本 | 5 |
在 EP 管中按順序加入上述試劑，立即混勻并計時，立即取 200µL 轉(zhuǎn)移至微量玻璃比色皿或 96
孔板中，記錄 470nm 下 30s 時的吸光值 A1 和 1min30s 后的吸光值 A2。計算?A＝A2-A1。
POD 活性計算：
用微量玻璃比色皿測定的計算公式如下
1、按血清（漿）體積計算
單位定義：每 mL 血清（漿）在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。
POD（U/mL）＝?A÷0.01×V 反總÷V 樣÷T =4900×?A
2、按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。
POD（U/mg prot）＝?A÷0.01×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T =4900×?A÷Cpr 3、按樣本鮮重計算
單位定義：每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。
POD（U/g 鮮重）＝?A÷0.01×V 反總÷（W÷V 樣總×V 樣）÷T =4900×?A÷W 4、按細菌或細胞數(shù)量計算
單位定義:每 1 萬個細菌或細胞在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 定義為一個酶活力單位。
POD（U/104 cell）＝?A÷0.01×V 反總÷（500÷V 樣總×V 樣）÷T =9.8×?A
用 96 孔板測定的計算公式如下
1、按血清（漿）體積計算
單位定義：每 mL 血清（漿）在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 定義為一個酶活力單位。
POD（U/mL）＝?A÷0.005×V 反總÷V 樣÷T =9800×?A
2、按樣本蛋白濃度計算
單位定義：每 mg 組織蛋白在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 定義為一個酶活力單位。
POD（U/mg prot）＝?A÷0.005×V 反總÷（Cpr×V 樣）÷T =9800×?A÷Cpr 3、按樣本鮮重計算
單位定義：每 g 組織在每 mL 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 定義為一個酶活力單位。
POD（U/g 鮮重）＝?A÷0.005×V 反總÷（W÷V 樣總×V 樣）÷T =9800×?A÷W 4、按細菌或細胞數(shù)量計算
單位定義：每 1 萬個細菌或細胞在每mL 反應(yīng)體系中每分鐘A470 變化 0.005 定義為一個酶活力單位。
POD（U/104 cell）＝?A÷0.005×V 反總÷（500÷V 樣總×V 樣）÷T =19.6×?A
V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.245mL；V 樣：加入樣本體積，0.005mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。
注意事項：
1、 如一次測定的樣本數(shù)量較多，可將試劑一、二、三和蒸餾水按照比例混合，在 37℃（哺乳動物） 或
25℃（其它物種）放置 10min，測定時加入 240µL 即可。
2、 樣本測定值如果小于 0.005，可將反應(yīng)時間延長到 3-5 分鐘，計算時除以反應(yīng)時間即可；如果高于 0.5，可將樣本用提取液進行稀釋。計算時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可。
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