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Annexin V-Alexa Fluor 488/PI凋亡檢測試劑盒說明書
Annexin V-Alexa Fluor 488/PI Apoptosis Detection Kit
目錄號：K2576
保存：2-8 ℃避光保存
組分說明
Cat.No. K2576
KitSize 50
4×BindingBuffer 10ml
PropidiumIodide,PI 500 μl
AnnexinV-AlexaFluor488 250 μl
產(chǎn)品簡介
AnnexinV-AlexaFluor488/PI 凋亡檢測試劑盒是一種采用AnnexinV-AlexaFluor488 與PI 雙染法進(jìn)行細(xì)胞早期凋亡分析的檢測試劑盒。
細(xì)胞凋亡早期改變發(fā)生在細(xì)胞膜表面，這些細(xì)胞膜表面的改變之一是磷脂酰絲氨酸（PS）從細(xì)胞膜內(nèi)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外，使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。PS 是一種帶負(fù)電荷的磷脂，正常主要存在于細(xì)胞膜的內(nèi)面，在細(xì)胞發(fā)生凋亡時細(xì)胞膜上的這種磷脂分布的不對稱性被破壞而使 PS 暴露在細(xì)胞膜外。AnnexinV 具有易于結(jié)合到磷脂類如 PS 的特性，對 PS 有高度的親和性。因此，該蛋白可充當(dāng)一敏感的探針檢測暴露在細(xì)胞膜表面的 PS。PS 轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜外不是凋亡所*的，也可發(fā)生在細(xì)胞壞死中。兩種細(xì)胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細(xì)胞膜是完好的，而細(xì)胞壞死在其早期階段細(xì)胞膜的完整性就被破壞。另外一種活細(xì)胞非透過性熒光染料碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）不能通過完整的活細(xì)胞，但能夠?qū)乃篮偷蛲鐾砥诘募?xì)胞進(jìn)行染色，因此通常將AnnexinV 與 PI 配合染色，以區(qū)別凋亡早期細(xì)胞與壞死細(xì)胞和凋亡的晚期細(xì)胞。
注意事項
1. 消化細(xì)胞時不能用含EDTA 的胰酶。
2. 本試劑盒需使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。
3. 需自備PBS 和去離子水。
4. 熒光染料均存在淬滅問題，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
5. PI 對人體有刺激性，請注意適當(dāng)防護(hù)。
6. 請穿實驗服并戴一次性手套操作。
操作步驟
1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：
a. 對于貼壁細(xì)胞：小心收集細(xì)胞培養(yǎng)液到一離心管內(nèi)備用。用胰酶消化細(xì)胞，至細(xì)胞可以被輕輕用移液管或槍頭吹打下來時，加入前面收集的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打下所有的貼壁細(xì)胞，并輕輕吹散細(xì)胞。再次收集到離心管內(nèi)。1000×g 左右離心3-5 分鐘，沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約50μl 左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清。再次加入1ml4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞。
b. 對于懸浮細(xì)胞：1000×g 左右離心3-5 分鐘，沉淀細(xì)胞。對于特定的細(xì)胞，如果細(xì)胞沉淀不充分，可以適當(dāng)延長離心時間或稍稍加大離心力。小心吸除上清，可以殘留約 50 微升左右的培養(yǎng)液，以避免吸走細(xì)胞。加入約1ml 4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，并轉(zhuǎn)移到1.5 毫升離心管內(nèi)。再次離心沉淀細(xì)胞，小心吸除上清，可以殘留約 50μl 左右的 PBS，以避免吸走細(xì)胞。再次加入1ml4℃預(yù)冷的PBS，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞。
2. 用去離子水按 1:4 稀釋BindingBuffer（4mlBindingBuffer+12ml 去離子水）；
3. 用 250μlBindingBuffer 重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)其濃度為 1×106/ml；
4. 取100μl 的細(xì)胞懸液于 5ml 流式管中，加入5μlAnnexinV-AlexaFluor488 和 10 μl20μg/ml 的 PI 溶液；
5. 混勻后于室溫避光孵育 15 分鐘；
6. 在反應(yīng)管中加 400μlPBS，流式細(xì)胞儀（FACS）分析。
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